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第 37 卷 分析化学 ( FENX I HUAXUE) 2009 年 2 月 研究报告 第 2期 Chinese Journal of Analytical Chem istry 237 ～241 电喷雾解吸电离质谱快速测定吴茱萸中生物碱 陈焕文 1 1, 3 郑健 (东华理工学院 ,抚州 344000 ) 3 摘 要 3 2, 3 王伟萍 2 1 陈昌林 1 王志畅 1 (北京市理化分析测试中心 ,北京 100089 ) (吉林大学化学院 ,长春 130023 ) 生物碱是许多中草药的活性有效成分 ,其含量的多少和种类的差异是导致中草药品质差异的重要 因素 。本文利用电喷雾解吸电离质谱 (DESI2M S)能够在不需要样品预处理的前提下进行复杂基体样品分析 的特点 ,采用酸性甲醇 2水混合溶液作为喷雾试剂 ,在优化了的实验条件下快速获得了吴茱萸的 DESI2M S指纹 谱图 ,然后利用串联质谱对其中有重要活性的 5 种生物碱进行了结构鉴定 。实验表明 ,基于固体表面解吸电 离质谱分析的方法不需要萃取 2分离手续 ,单个样品测定时间不超过 1. 5 m in,大幅度提高了分析速度 ,有望在 药品品质的在线监测和工艺过程控制中发挥重要作用 。 关键词 1 引 电喷雾解吸电离质谱 ,吴茱萸 ,快速测定 ,生物碱 言 吴茱萸 ( F ructus Evod iae)是常用的中草药之一 ,其品质最好的是芸香科植物吴茱萸的干燥未成熟果 实 ,具有温中 、 止痛 、 理气 、 燥湿 、 疏肝 、 散寒 、 止呕等多种功效 。吴茱萸在中成药中需要粉碎后制作散剂 或丸剂 , 临床上多作单方或复方用于治疗胃腹冷痛 、 高血压 、 寒疝疼痛 、 神经性皮炎 、 口腔溃疡及疥疮 [1] [ 1, 2 ] 等 。研究认为 ,其主要活性成分为吴茱萸生物碱 ,生物碱的种类和含量与吴茱萸的品质相关 。到 [ 2 ～4 ] 目前为止 ,对吴茱萸生物碱的测定方法主要有薄层扫描 ,毛细管电泳及高效液相色谱法 。这几种测 定方法为吴茱萸中的两种主要生物碱 (吴茱萸碱和吴茱萸次碱 ) 提供了较为满意的定性定量信息 , 由于 灵敏度 、 参照物等方面的影响 ,对吴茱萸中尚缺少标准物质的生物碱成分的检测显得无能为力 。液 2质 联用技术具有极强的定性能力 ,可有效地分析复杂混合物的单个和多个组分 ,曾经用来对吴茱萸生物碱进 行分析 。但在常规 LC 2MS联用中 ,首先要将制药工艺中已经粉碎的样品进行萃取 ,然后在一定条件下 进行色谱分离 ,最后才能够用电喷雾电离 ( ESI)或大气压化学电离 (APC I)质谱检测 。 [ 6 ～8 ] 电喷雾解吸电离 (DESI)是一种新兴的离子化技术 ,其主要优点是能够在大气压下直接对固体 表面的痕量物质进行解吸电离 ,形成离子后被质谱检测 。由于在大气压下进行操作 (样品更换等较便 利 )和不需要样品预处理 ,使得 DESI适合于进行现场 、 在线分析 ,具有灵敏度高 、 速度快 、 特异性好等特 [5] [ 9, 10 ] 点 。自 DESI于 2004 年后期问世以来 ,已经广泛地应用到各种爆炸物现场检测 、 生物组织的质谱成 [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] 像 、 植物中生物碱分析 、 各种形态的化学药品在线分析 、 食品分析 和临床样品分析 等领 域 。本实验将 DESI2M S用于芸香科植物吴茱萸干燥未成熟果实的快速分析 。结果表明 , DESI2M S不但 [ 12 ] 可用于化学制药工业中对成药品质进行监测 ,还可根据吴茱萸中主要生物碱组分对吴茱萸的真伪进 行快速鉴定 。 2 实验部分 2. 1 仪器与试剂 LTQ 线性离子阱质谱仪 (美国热电菲尼根质谱公司 ) ; 电喷雾解吸电离 ( DESI) 离子源 (自制 ) ; 红外 光谱仪的制样器 (天津天光光学仪器设备有限公司 ) 。吴茱萸 、 曼陀罗等药材 (南昌开心人中药房 ) ; 甲 醇、 甲酸 、 氨水 ,均为分析纯 (天津市大茂化学试剂厂 ) ; 去离子水 ,实验室自制 。 2008 203 226 收稿 ; 2008 211 224 接受 本文系国家自然科学基金 ( No. 20505003 ) 资助项目 3 E 2mail: zhjianhb@ gmail. com 分析化学 238 第 37 卷 2. 2 电喷雾解吸电离 ( D ES I)离子源 DESI电离源实际上由一个略微倾斜的电喷雾源 ( ESI) 和一个样品支架组成 ,整套装置放置在一个 固定的平台上 ,并且能够通过 3 2D 调节架来调节其相对位置 ,使 ESI喷嘴 、 样品表面以及 LTQ 采样锥形 成一定的夹角 ,以便在样品表面产生的离子能够更好地引入到质谱仪中进行质量分析 。关于 DESI源 的详细描述 、 优化等参见文献 [ 11 ～14 ]。在通过碰撞诱导解离 ( C ID )进行串联质谱分析时 ,母离子选择 窗口宽度为 1. 5 质荷比单位 ,碰撞能量为 20% ～30% 。 2. 3 实验方法 2. 3. 1 样品处理 称取 500 g清洁干燥的药用吴茱萸于洁净的粉碎机中粉碎 ,过 0. 128 mm 孔径筛 ,然 后把剩余药渣继续研磨 ,过筛后再充分搅拌以混合均匀 。如此反复多次 ,直到所有药渣全部研细并且混 合均匀 。由于粉末样品难以直接在 DESI源中进行分析 , 故采用红外光谱仪的制样器将粉末样品压制 成厚度约 1 mm 的药片备用 。实验时 ,将药片放置在样品支架上 , 然后调整好样品支架和 DESI源的位 置 。为了获得更好的信噪比 ,每张质谱的平均扫描时间为 1. 5 m in。 2. 3. 2 正离子模式下 D ES I2M S主要工作参数 质量范围为 50 ～500 Th; 鞘气流速 、 辅助气体流速均 为 0 mL /m in; 喷雾溶剂流速为 3 mL /m in; 雾化气线性流速约为 300 m / s; 喷雾电压为 5 kV ,毛细管电压 为 12 V ,透镜电压为 100 V; 毛细管温度为 275 ℃; 喷雾溶剂为甲醇 ∶ 水∶ 甲酸 = 49 ∶ 49 ∶ 2 (V /V ) ; 质谱入口 与样品表面的距离为 5 mm; 喷雾针尖与样品表面的距离为 2 mm; 喷雾针与样品表面的角度 (α) 为 45 ° ; 样品表面与质谱入口毛细管的角度 (β)为 15 ° 。 3 结果与讨论 3. 1 仪器工作条件的优化 为了优化仪器的工作条件和实验参数 , 首先使用常见的中药曼陀罗 ( Datura stramonium ) 的根茎进 行 DESI2M S分析 ,结果获得了如图 1 a所示的曼陀罗的质谱图 。从图 1a 上可以看出 ,曼陀罗的 DESI谱 图与文献 [ 11 ]的结果基本一致 ,采集到大部分生物碱质谱峰 。为了进一步确定所获得的实验结果 , 选 择了曼陀罗中东莨菪碱的分子离子峰 ( m / z 304 ) 进行串联质谱分析 。在给定的 C ID 条件下 , 获得了如 图 1b所示的谱图 ,所获得的碎片与文献 [ 11 ]报道一致 。因此表明 DESI实验中所选定的仪器的工作条 件 (如角度 、 电压等 )正确 ,能够获得良好的信号 。 图 1 曼陀罗 DESI2M S谱图 ( a )和其组织中东莨菪碱的二级质谱 ( b ) Fig. 1 Desorp tion electrosp ray ionization (DESI) 2M S of Datura stramonium ( a ) and C ID spectrum of p rotonated scopolam ine (m / z 304 ) ( b ) , show ing rep roducibility and app rop riate operation parameters for DESI experim ents 1. 3 2多聚乙烯羟基 26, 7 2二羟基托烷 ( 3 2tygloyloxy26, 7 2dihydroxytropane) ; 2. 东莨菪碱 ( scopolam ine) ; 3. 3, 6 2二 聚乙烯羟基 27β2酚 酮 ( 3, 6 2ditygloyloxy27β2hydroxytropane ) ; 4. 3 2乙 酸 基 26 2酚 酮 ( 3 2acetoxy26 2hydroxytropane ) ; 5. 3 2β2二聚乙烯羟基 6 2异戊含氧酰基 27 2酚酮 ( 3β2tygloyloxy26 2isovaleroyloxy27 2hydroxytropane) ; 6. 3 2含 氧 托 品 酰基 26 2聚乙烯羟基托烷 ( 3 2tropoyloxy26 2tygloyloxytropane) 。 DESI进行离子化的机理虽然还没有最终定论 ,但是被认为主要是离子 2分子间的质子转移反应 [6] 。 因此 ,溶剂的质子化能力对信号的强度具有较大的影响 。本实验考察了 1%氨水 、1%甲酸 、 中性水 , 中 第 2期 陈焕文等 : 电喷雾解吸电离质谱快速测定吴茱萸中生物碱 239 性甲醇 、 中性甲 醇 2水 混 合溶 液 ( 1 ∶ 1, V /V ) 、 碱 性 甲 醇 2水 2氨 ( 49 ∶ 49 ∶ 2, V /V ) 和 酸 性 甲 醇 2水 2甲 酸 ( 49 ∶ 49 ∶ 2, V /V )对曼陀罗的信号的影响 。实验发现 ,在正离子工作模式下 ,碱性溶液对曼陀罗的信号有 一定的抑制作用 ,而酸性溶液则能够对信号有较好的增强作用 。实验表明 ,在正离子检测模式下 , 酸性 溶液对 DESI信号有较好的增强作用 ,而在负离子检测模式下 ,碱性溶液对信号具有较好的效果 。这与 [ 6, 13 ] DESI中离子 2分子反应机理一致 。无论何种检测模式 , 一般需要在喷雾溶剂中添加一定的甲醇等 有机溶剂 ,主要是为了减小水的表面张力 ,使得喷雾更加均匀细致 。由于需要测定的主要成分是吴茱萸 中具有一定碱性的生物碱 ,因此 ,实验选定甲醇 2水 2甲酸 ( 49 ∶ 49 ∶ 2, V /V ) 混合溶液为 DESI喷雾所用的 溶液 。实验还考察了甲醇 2水 2甲 酸 ( 49 ∶ 49 ∶ 2, V /V ) 溶液的流速对信号的影响 , 并且发现在流速为 3 μL /m in时信号的强度已经达到最大而且稳定 。因此 ,本实验选择了 3 μL /m in。 3. 2 吴茱萸的 D ES I质谱检测 在已经优化的实验条件下 ,按照实验条件操作 ,获得的吴茱萸的 DESI2M S谱图如图 2 所示 。由图 2 可知 ,吴茱萸的 DESI2M S谱图比较杂乱 ,尤其是在 m / z 200 ～400 区间内具有许多可以识别的峰 ( S /N ≥ [ 5, 16, 17 ] 3 ) 。从前人的工作可知 ,吴茱萸主要活性成分是生物碱 , 分别为吴茱萸碱 (分子量 303 ) 、 吴茱萸 酰胺 (分子量 307 ) 、 羟基吴茱萸碱 (分子量 319 ) 、 吴茱萸次碱 (分子量 287 ) 和吴茱萸酰胺甲 (分子量 305 ) 。由于喷雾溶剂为酸性 ,具有较强的质子化能力 ,而所测定的生物碱均具有较强的碱性 。因此 ,在 此实验条件下 ,在 DESI2M S中观测的应该是这些生物碱的质子化分子离子 。从图 2 可以看出 , 在 m / z 304、308、320、288 和 306 处分别观测到了较强的质谱峰 ,正好与吴茱萸 5 种生物碱的分子离子相对应 。 为了进一步确定所获得的这些质谱峰 ,分别按照实验部分进行操作 ,考察了这些离子的二级串联质谱 , 其中吴茱萸碱和吴茱萸酰胺的 C ID 谱图分别如图 3a 和图 3b 所示 。 图 2 吴茱萸的 DESI2M S谱图 Fig. 2 图 3 吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸酰胺的 C ID 质谱 DESI2M S of F ructus Evod iae p lant tissue using acidic sp raying solvent Fig. 3 DESI2M S/M S of evodiam ine and evodiam ide in p lant tissue 图 3a 中碎片 m / z 171 为母离子丢失碎片 C8 H7 NO (结构式 Ⅰ)后所得 。与此途径竞争的是另外一种 裂解方式 ,即丢失碎片 C11 H10 N2 (结构式 Ⅱ)后得到 m / z 134; 从图中可以看出 m / z 134 的丰度比 m / z 171 略微高些 ,表明在该实验条件下两种裂解途径都存在 ,且丢失碎片 Ⅱ的方式略占优势 。图 3b 为吴茱萸 酰胺质子化分子离子的二级质谱 ,其中 m / z 178 是母离子丢失碎片 C9 H8 N (结构式 Ⅲ) 后得到的碎片离 子 ,该离子不稳定 ,能够继续裂解 ,如果丢失碎片 CH3 和 H2 后则得到 m / z 161,如果丢失 CH3 NHCH2 后 则得到 m / z 134。由于 m / z 134 的丰度较高 ,可能在该条件下更有利于此裂解方式的发生 。另外 , 母离 子 m / z 320 获得的碎片离子主要有 m / z 304, 144,分别由母离子丢失甲烷和碎片 C9 H8 N2 O2 (结构式 Ⅳ) 所得 ; 母离子 m / z 288 的碎片较少 ,在较高能量下获得的碎片主要有由于丢失水而获得的 m / z 270; 母离 子 m / z 306 的碎片主要有 m / z 288,是该离子丢失 H2 O 后得到的碎片离子 。从获得的碎片情况看 ,所有 [ 5, 16, 17 ] 母离子的结构与此 5 种吴茱萸生物碱的质子化分子离子结构一致 ,而且与文献报道的结果一致 。 因此 ,可以确定在 DESI2M S谱图上观测到的质谱峰 m / z 304, 308, 320, 288 和 306 分别为吴茱萸碱 (分子 量 303 ) 、 吴茱萸酰胺 (分子量 307 ) 、 羟基吴茱萸碱 (分子量 319 ) 、 为吴茱萸次碱 (分子量 287 ) 和吴茱萸 酰胺甲 (分子量 305 )的质子化分子离子 。 C ID 过程中形成的碎片的可能结构如下 [5] : 分析化学 240 第 37 卷 + 实验发现 ,大部吴茱萸分生物碱能够和碱金属盐 (如 Na ) 形成加合物 , 比如 DESI2M S中 m / z 330, + + 637 分别为吴茱萸酰胺 (分子量 307 ) 的钠离子化峰 (M + Na ) 和双分子钠离子化峰 ( 2M + Na ) ; m / z 326, 629 是吴茱萸碱 (分子量 303 )的钠离子化峰和双分子钠离子化峰 。这种情况在 DESI中经常出 现 ,尤其是当碱性物质的浓度较大或碱性较强以及样品或溶液中含有浓度较高的碱金属离子时更是如 [ 13, 15 ] 此 。本实验的样品中可能含有少量钠盐 ,因为在 LC 2ESI2M S进行吴茱萸生物碱测定时观测到明显 [5] 的钠离子加合物 。 3. 3 样品制备及其杂质的影响 DESI技术的突出优点是在不需要进行样品预处理的情况下 ,能对复杂固体样品进行快速的质谱分 析 。比如在毒芹的 DESI2M S分析时 ,直接将植物放在 DESI喷嘴下即可得到很强的质子化 γ2毒芹碱信 [ 12 ] 号 (m / z 126 ) 。因此 ,本实验中也曾采用吴茱萸果实直接进行测定 。在同样的条件下 ,也能够获得基 本上与研磨后的样品一致的谱图 ,但是对低含量的生物碱 ,例如吴茱萸酰胺则难以获得很好的信号 ,尤 其是当样品的表面沾有灰尘等杂质时 ,干扰更加严重 。这可能是因为与毒芹相比 ,吴茱萸中的一些生物 碱 ,如吴茱萸酰胺等 ,比毒芹中的生物碱更难以挥发的缘故 。实践表明 ,不同产地的中药品质和性能有 差异 ,在临床上的效果也很不相同 。例如文献 [ 5 ]报道不同产地吴茱萸的生物碱种类基本一致 ,但是含 [5] 量差异很大 。因此 ,为了尽可能消除 DES I测定中带来的系统误差 , 还是建议将样品进行研磨后使 [ 12 ] [ 13 ] 用 。当然 ,如果是挥发性成分 或大量成分 的测定则无需研磨 。但是 , 不管是否研磨 , 与常规的色 谱 2质谱联用技术相比 , DESI不需要进行萃取 、 分离等处理手段 ,尚可节省大量时间 。 除了样品的制备可能带来影响外 ,样品的纯度也对结果具有重要影响 。比如将吴茱萸样品置换成 曼陀罗后则获得了完全相异的 DESI2M S谱图 ,即使能够观测到 m / z 304,但其二级质谱与吴茱萸中观测 到的 m / z 304 的二级质谱完全不同 (参见图 1 和图 3 ) 。因此 ,还可据此做定性分析 。另外 ,如果将少量 的杂质如烟叶等研磨后混杂在吴茱萸样品中 ,获得的 DES I2M S谱图也完全不同 , 主要可能是烟叶中挥 发性物质更多 。因此 ,如果将 DESI2M S获得的中草药的指纹谱图与化学计量学工具 (如 PCA 等 ) 相结 合 ,将有可能对吴茱萸等中草药进行快速的鉴定 。 References 1 Pharmacopoeia Comm ission of the M inistry of Public Health, P. 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The operation parameters for both DESI and LTQ instrument were op 2 tim ized and tested by p reviously exam ined p lant tissue of Datura Stramonium so that a reliable fingerp rint of the F ructus Evod iae tissue was generated successfully using a m ixture of methanol/water/ form ic acid ( 49 ∶ 49 ∶ 2 ) as electro sp ray liquid. The alkaloids detected gave p redom inant signals at m / z 308, 304, 320, 288 and m / z 306, which were corresponding to the p rotonated molecules of evodiam ide, evodiam ine, hydroxyvodia2 m ine, rutae carp ine and goshuyuam ide 2Ⅰ, respectively. The structures of the p rotonated molecules were con2 firmed w ith high confidence by tandem DESI2M S /M S, which was facilitated by the unique features of LTQ mass spectrometer. Ionic adducts of alkaloids and sodium were also commonly observed in DESI mass spectra of the p lant tissue, and possible interference caused by dust, fake tissues were also investigated experim ental2 ly. A single run was comp leted in 1. 5 m in, p roviding a fast method for fingerp rinting volatile compounds in p lant tissue. It has been demonstrated that DESI is not only potentially useful fo r the quality monitoring of p roducts in pharmaceutical p rocesses, but also useful to discrim inate authentic or fake F ructus Evod iae based on their mass spectral fingerp rints. Keywords Desorp tion electrosp ray ionization, mass spectrom etry, F ructus Evod iae, fast direct detection ( Received 26 March 2008; accep ted 24 November 2008 )