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生物检材中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的液相色谱-串联质谱检验方法.pdf

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司 法 鉴 定 技 术 规 范 SF/Z JD0107021——2018 生物检材中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素 己的液相色谱-串联质谱检验方法 Determination of koumine, gelsemine and gelsenicine in biological samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2018-11-08 发布 中华人民共和国司法部公共法律服务管理局 2019-01-01 实施 发 布 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 原理 .............................................................................. 1 5 试剂、仪器和材料 .................................................................. 1 6 操作方法 .......................................................................... 2 7 分析结果评价 ...................................................................... 7 附录 A(资料性附录) 钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己相关资料 ............................ 8 附录 B(资料性附录) 钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己相关研究数据 ........................ 9 附录 C(资料性附录) 血液样品的 MRM 色谱图 ........................................... 10 附录 D(资料性附录) 方法学有效性验证数据 ........................................... 11 表 1 流动相梯度洗脱程序 .............................................................. 3 表 2 钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己和内标士的宁的定性离子对、定量离子对和保留时间 ...... 4 表 3 相对离子对丰度比的最大允许相对误差(%) ........................................... 4 SF/Z JD0107021——2018 前 言 本技术规范按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本技术规范由司法鉴定科学研究院提出。 本技术规范由司法部公共法律服务管理局归口。 本技术规范起草单位:司法鉴定科学研究院。 本技术规范主要起草人:刘伟、沈敏、向平、沈保华、卓先义、严慧、吴何坚。 本技术规范的附录A、B、C、D为资料性附录。 本技术规范为首次发布。 II SF/Z JD0107021——2018 生物检材中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的液相色谱-串联质谱检 验方法 1 范围 本技术规范规定了生物检材(血液、尿液和组织)中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检验方法。 本技术规范适用于生物检材中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的定性与定量分析,其它非生物检材 (可疑植物、食物、呕吐物等)中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的定性及定量分析可参照使用。钩吻 素子、钩吻素甲和钩吻素己的相关资料参见附录A。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GA/T 122 毒物分析名词术语 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 GA/T 122中界定的术语和定义适用于本技术规范。 4 原理 生物检材经液液提取后,用液相色谱-串联质谱法进行检测。经与平行操作的空白样品和添加样品 对照,以保留时间、质谱特征碎片离子峰和离子对相对丰度比进行定性分析;以峰面积为依据,采用外 标法或内标法进行定量分析。 5 试剂、仪器和材料 5.1 试剂 本技术规范所用试剂除另有说明外均为分析纯,试验用水为一级水(见GB/T 6682规定),所用试 剂: a) 甲醇:HPLC 级; b) 50%甲酸溶液:HPLC 级; c) 乙腈:HPLC 级; d) 乙酸铵:HPLC 级; e) 氢氧化钠; 1 SF/Z JD0107021——2018 f) 乙酸乙酯; g) 20mmol/L 乙酸铵溶液(含 0.1%甲酸和 5%乙腈):称取乙酸铵 0.77g 置于 500mL 容量瓶中, 加入适量水溶解,再加入 50%的甲酸溶液 1mL 和乙腈 25mL,以水定容至刻度 ,充分混匀即 可; h) 内标为士的宁或其它合适内标物; i) 标准物质溶液: 1) 1.0mg/mL 钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己标准储备溶液:分别取钩吻素子、钩吻素甲和 钩吻素己标准物质(纯度:>95%)10mg,精密称定,置 10mL 容量瓶中,加入适量甲醇 溶解并定容至刻度,分别配制成 1.0mg/mL 钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己标准储备溶液。 密封,置于冰箱中冷冻保存,保存时间 12 个月; 2) 钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己标准工作溶液:试验中所用其它浓度的钩吻素子、钩吻素 甲和钩吻素己标准工作溶液均由 1.0mg/mL 钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己标准储备溶液 用甲醇稀释得到,置于冰箱中冷藏保存,保存时间 3 个月; j) 内标士的宁标准物质溶液: 1) 1.0mg/mL 士的宁标准储备溶液:精密称取士的宁标准物质 10mg 置于 10mL 容量瓶中, 加入适量甲醇溶解并定容至刻度,配制成 1.0mg/mL 士的宁标准储备溶液。密封,置于冰 箱中冷冻保存,保存时间 12 个月; 2) 2µg/mL 士的宁标准工作溶液:移取 1.0mg/mL 士的宁标准储备溶液适量至容量瓶中,加 入甲醇稀释,混匀,配制成 2µg/mL 士的宁标准工作溶液。密封,置于冰箱中冷藏保存, 保存时间 3 个月。 5.2 仪器和材料 仪器和材料包括: a) 液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源(ESI) b) 电子分析天平:感量 0.1mg; c) 涡旋振荡器; d) 离心机; e) 恒温水浴锅; f) 移液器。 6 操作方法 6.1 定性分析 6.1.1 样品前处理 6.1.1.1 案件样品 6.1.1.1.1 血液、尿液样品 移取血液或尿液0.5mL,加入1%NaOH溶液50μL,涡旋混合1min,再加入乙酸乙酯3mL提取,涡旋 2min后,以3000r/min离心3min。取上清液在55℃水浴空气流下吹干,残留物用混合溶液[甲醇:[20mmol/L 乙酸铵溶液(含0.1%甲酸和5%乙腈)(体积比7:3)]100μL复溶,混匀后,供仪器分析。 6.1.1.1.2 组织样品 2 SF/Z JD0107021——2018 称取剪碎组织0.5g,加入1%NaOH溶液800μL,涡旋混合1min,再加入乙酸乙酯3mL萃取,涡旋3min 后,以3000r/min离心3min。取上清液在55℃水浴空气流下吹干,残留物用混合溶液[甲醇:[20mmol/L乙 酸铵溶液(含0.1%甲酸和5%乙腈)(体积比7:3)]200μL复溶,涡旋均匀后转移至1.5mL离心管中,于-20℃ 冰箱中放置30min,以13000r/min离心2min,取上清液,供仪器分析。 6.1.1.2 控制样品 取等量相同基质空白样品两份,一份作为空白样品,一份添加50ng/mL的钩吻素子、钩吻素甲和 5ng/mL钩吻素己标准工作溶液10µL,作为添加样品,余下同6.1.1.1.1或6.1.1.1.2,与案件样品平行操作。 6.1.2 仪器检测 6.1.2.1 仪器条件 6.1.2.1.1 液相色谱条件 以下条件作为参考,可根据不同仪器实际情况进行调整: a) 色谱柱:ZORBAX SB-C18 柱(或其它等效柱),150mm2.1mm,5m 注:ZORBAX SB-C18柱为Agilent公司产品的商品名称,给出这一信息是为了方便本技术规范的使用者,并不是表示 对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品。 b) 流动相:A:20mmol/L 乙酸铵溶液(含 0.1%甲酸和 5%乙腈),B:甲醇,流动相梯度洗脱程序 见表 1; 表1 流动相梯度洗脱程序 时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%) 0 90 10 0.5 90 10 0.6 60 40 1.5 60 40 1.6 30 70 5.5 30 70 5.6 90 10 8.0 90 10 c) 流速:200L/min; d) 柱温:室温; e) 进样量:10L。 6.1.2.1.2 质谱条件 以下条件作为参考,可根据不同仪器实际情况进行调整: a) 离子源:电喷雾电离-正离子扫描(ESI+); b) 检测方式:多反应监测(MRM); c) 离子源电压(IS):5500V; 3 SF/Z JD0107021——2018 d) 碰撞气(CAD)、气帘气(CUR)、雾化气(GS1)、辅助气(GS2)均为高纯氮气,使用前调节各气流 流量以使质谱灵敏度达到检测要求; e) 去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)等电压值应优化至最佳灵敏度,参见附录 B。 在以上色谱、质谱条件下,钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己与内标士的宁的定性离子对、定量 离子对和保留时间见表 2,色谱图参见附录 C。 表2 钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己和内标士的宁的定性离子对、定量离子对和保留时间 定性离子对/ 定量离子对/ 保留时间/ (m/z) (m/z) (min) 307.3/180.2 3.76 323.4/70.1 3.58 327.3/296.2 3.89 335.0/184.0 3.70 化合物 307.3/180.2 钩吻素子 307.3/70.1 323.4/70.1 钩吻素甲 323.4/236.1 327.3/296.2 钩吻素己 327.3/265.1 335.0/184.0 士的宁 335.0/156.3 6.1.2.2 进样 分别吸取案件样品、空白样品和添加样品提取液,按6.1.2.1条件进样分析。 6.1.2.3 记录 记录各样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己可疑色谱峰的保留时间、离子对丰度比。 6.1.2.4 定性判断依据 以保留时间、质谱特征碎片离子峰和离子对相对丰度比作为定性判断依据。 如果案件样品中出现钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己两对定性离子对的特征色谱峰,保留时间与添 加样品中相应标准物质的色谱峰保留时间比较,相对误差在2.5%以内,且定性离子对丰度比与浓度相 近添加样品的离子对丰度比之相对误差不超过表3规定的范围,则可判断案件样品中存在该种目标物。 表3 相对离子对丰度比的最大允许相对误差(%) 相对离子对丰度比 >50 >2050 >1020 10 允许的相对误差 20 25 30 50 6.2 定量分析 本技术规范采用外标法或内标法定量分析。 4 SF/Z JD0107021——2018 6.2.1 样品前处理 移取(或称取)案件样品血液0.5mL(或尿液0.5mL,组织0.5g)两份,加2µg/mL士的宁标准工作 溶液10µL(外标法可不用加),再加入1%NaOH溶液50µL(或800µL),余下同6.1.1.1.1(或6.1.1.1.2)。 另取相同基质空白样品若干份,添加适量钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己,制得系列浓度或单点浓 度的添加样品,与案件样品平行操作。方法学有效性验证数据参见附录D。 案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的浓度应在工作曲线的线性范围内。配制单点浓度的添 加样品时,案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己浓度需在该浓度的±50%内。 6.2.2 仪器检测 6.2.2.1 仪器条件 同6.1.2.1。 6.2.2.2 进样 分别将案件样品、系列浓度的添加样品或单点浓度添加样品,按6.1.2.1条件进样分析。 6.2.3 记录与计算 记录案件样品、系列浓度的添加样品或单点浓度添加样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己及内标 物定量离子对的峰面积值,然后计算案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己含量。 6.2.3.1 外标法 6.2.3.1.1 外标-工作曲线法 在系列浓度的添加样品中,以钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己定量离子对的峰面积值(Y)为纵坐 标、钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己含量(C)为横坐标进行线性回归,得线性方程。 根据案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的峰面积值,按公式(1)计算出案件样品中钩吻素 子、钩吻素甲和钩吻素己的含量。 C= Y −a b ................................................................................. (1) 式中: C——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量,单位为纳克每毫升(ng/mL)或纳克每 克(ng/g); Y——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的峰面积值; a ——线性方程的截距; b ——线性方程的斜率。 6.2.3.1.2 外标-单点校正法 根据案件样品和添加样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的峰面积值,按公式(2)计算出案件 样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量。 C= A c ............................................................................(2) A 5 SF/Z JD0107021——2018 式中: C——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量,单位为纳克每毫升(ng/mL)或纳克每 克(ng/g); A——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的峰面积值; A′——添加样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的峰面积值; c——添加样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量,单位为纳克每毫升(ng/mL)或纳克每 克(ng/g)。 6.2.3.2 内标法 6.2.3.2.1 内标-工作曲线法 在系列浓度的添加样品中,以钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己与内标定量离子对的峰面积比(Y) 为纵坐标,钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己含量(C)为横坐标进行线性回归,得线性方程。 根据案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己与内标的峰面积比,按公式(3)计算出案件样品中 钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量。 C = Y −a ............................................................................... (3) b 式中: C——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量,单位为纳克每毫升(ng/mL)或纳克每 克(ng/g); Y——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己与内标的峰面积比; a ——线性方程的截距; b——线性方程的斜率。 6.2.3.2.2 内标-单点校正法 根据案件样品和添加样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己与内标的峰面积比,按公式(4)计算 出案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量。 C= A c ............................................................................(4) A 式中: C——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量,单位为纳克每毫升(ng/mL)或纳克每 克(ng/g); A——案件样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己与内标的峰面积比; A′——添加样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己与内标的峰面积比; c——添加样品中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的含量,单位为纳克每毫升(ng/mL)或纳克每 克(ng/g)。 6.2.4 计算相对相差 案件样品按以上步骤平行测定两份,双样相对相差按公式(5)计算: 6 SF/Z JD0107021——2018 RD= C1 − C2 C 100 %..............................................................(5) 式中: RD——相对相差(%); C1、C2 ——两份案件样品平行定量测定的结果,单位为纳克每毫升(ng/mL) 或纳克每克(ng/g); C ——两份案件样品平行定量测定结果的平均值(C1+C2)/2,单位为纳克每毫升(ng/mL) 或纳克每克 (ng/g)。 7 分析结果评价 7.1 定性分析结果评价 7.1.1 阴性结果评价 如果案件样品中未检出钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己,添加样品中检出钩吻素子、钩吻素甲和钩 吻素己,则阴性结果可靠;如果添加样品中未检出钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己,则阴性结果不可靠, 应按6.1重新提取检验。 7.1.2 阳性结果评价 如果案件样品中检出钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己且空白样品无干扰,则阳性结果可靠;如果空 白样品亦呈阳性,则阳性结果不可靠,应按6.1重新提取检验。 7.2 定量分析结果评价 两份案件样品的相对相差不超过20%(腐败检材不超过30%)时,结果按两份案件样品含量的平均 值计算,否则需要重新测定。 7 SF/Z JD0107021——2018 AA 附 录 A (资料性附录) 钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的相关资料 钩吻为马钱科胡蔓藤属植物胡蔓藤的全株。在民间,钩吻以外用为主,具有祛风、杀虫止痒、消肿 拔毒的疗效。钩吻主要化学成分为吲哚类生物碱,是其产生药理活性和剧烈毒性的主要来源。 钩吻具极强的神经毒,主要抑制延脑的呼吸中枢,引起呼吸中枢麻痹,导致呼吸衰竭死亡。其中毒 症状包括消化系统:口腔、咽喉灼痛,恶心、腹痛、腹胀、腹泻或便秘等;神经系统:眩晕、言语含糊、 吞咽困难,肌肉松弛无力、呼吸肌麻痹、昏迷等;循环和呼吸系统:中毒早期心跳缓慢,呼吸快而深, 之后心搏加快,呼吸慢而浅、不规则,后期呼吸困难,体温及血压下降,严重者昏迷抽搐,最终死于呼 吸麻痹,一般4-8h死亡。 钩吻中毒致死量:钩吻根2-3g;新鲜嫩芽7个;钩吻素子0.15~0.3g。 国产钩吻的毒性成分吲哚类生物碱中以钩吻素子含量最高,钩吻素甲含量次之;钩吻素己毒性最大。 钩吻素己LD50:0.165mg/kg(小鼠腹注);钩吻素子LD50:3.60mg/kg(小鼠肌注),3.07mg/kg(小鼠 静注),99mg/kg(小鼠腹注)。 8 SF/Z JD0107021——2018 BB 附 录 B (资料性附录) 钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己相关研究数据 B.1 钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己和内标士的宁的LC-MS/MS参数 表B.1 钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己和内标士的宁的 LC-MS/MS 参数 化合物 定性离子对/(m/z) 去簇电压/V 碰撞能量/eV 驻留时间/ms 钩吻素子 307.3/180.2 70 65 100 307.3/70.1 70 61 100 323.4/70.1 80 58 100 323.4/236.1 80 37 100 327.3/296.2 70 26 100 327.3/265.1 70 39 100 335.0/184.0 100 52 100 335.0/156.3 100 63 100 保留时间/min 3.76 钩吻素甲 3.58 钩吻素己 3.89 士的宁 3.70 9 SF/Z JD0107021——2018 CC 附 录 C (资料性附录) 血液样品的 MRM 色谱图 C.1 空白血液的MRM色谱图 图C.1 空白血液的 MRM 色谱图 C.2 血液添加样品的MRM色谱图 1 2 4 3 图C.2 血液添加样品中钩吻素子(10ng/mL) 、钩吻素甲(10ng/mL) 、钩吻素己(1ng/mL)及内标士的 宁(40ng/mL)的 MRM 色谱图 (1.钩吻素甲 2.士的宁 3.钩吻素子 4.钩吻素己) 10 SF/Z JD0107021——2018 DD 附 录 D (资料性附录) 方法学有效性验证数据 D.1 工作曲线 数据采用:钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己定量离子对峰面积,内标法定量。 表D.1 各基质中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的线性范围、线性方程、相关系数、检出限(LOD) 及定量下限(LOQ) 检材 化合物 线性范围/ 线性方程 相关系数 LOD/(ng/mL LOQ/(ng/mL 或 /r 或 ng/g) ng/g) (ng/mL 或 ng/g) 血液 尿液 肝 钩吻素子 0.5-300 y=0.0881x+0.0236 0.9974 0.2 0.5 钩吻素甲 0.5-100 y=0.195x+0.0303 0.9977 0.2 0.5 钩吻素己 0.05-30 y=1.84x+0.0808 0.9971 0.02 0.05 钩吻素子 0.5-300 y=0.0485x+0.00866 0.9980 0.2 0.5 钩吻素甲 0.5-100 y=0.0973x+0.0126 0.9985 0.2 0.5 钩吻素己 0.05-30 y=1.56x+0.0575 0.9994 0.02 0.05 钩吻素子 0.5-400 y=0.0271x+0.0109 0.9960 0.2 0.5 钩吻素甲 0.5-300 y=0.0741x+0.0329 0.9967 0.2 0.5 钩吻素己 0.05-30 y=0.837x+0.0524 0.9957 0.02 0.05 D.2 方法精密度、准确度、回收率和基质效应 表D.2 各基质中钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己的精密度、准确度、回收率和基质效应 检材 化合物 钩吻素子 血液 钩吻素甲 钩吻素己 尿液 钩吻素子 添加样品含量/ 准确度/ 日内精密度/ 日间精密度/ 提取回收率/ 基质效应/ (ng/mL或ng/g) (%) (%) (n=6) (%)(n=24) (%) (%) 1 99.6 11.0 10.6 85.0 63.4 10 112.7 5.1 5.9 85.2 64.6 200 103.5 2.7 5.1 87.8 72.0 1 105.8 5.6 6.8 76.2 82.4 10 105.6 4.6 5.8 77.7 82.3 100 102.5 2.9 5.6 73.5 86.7 0.1 110.0 6.9 7.1 67.6 108.0 1 114.3 2.3 5.5 79.1 111.4 20 101.9 1.9 4.7 81.4 85.2 1 99.6 3.7 5.3 96.8 44.9 10 102.0 4.0 5.0 90.5 42.7 11 SF/Z JD0107021——2018 钩吻素甲 钩吻素己 钩吻素子 肝 钩吻素甲 钩吻素己 200 100.8 3.3 3.5 85.9 62.9 1 101.0 1.6 3.8 93.7 38.0 10 101.6 2.2 7.0 90.9 36.9 100 94.3 2.6 3.4 92.0 43.6 0.1 100.6 2.7 5.0 97.2 71.4 1 108.3 2.7 3.9 91.8 62.4 20 100.1 3.4 3.2 83.5 68.5 1 92.5 5.5 4.9 90.0 80.9 10 105.4 3.8 4.9 65.7 97.5 300 105.7 1.9 4.4 64.9 88.5 1 92.4 3.2 4.5 74.4 80.4 10 107.8 2.6 4.8 61.9 81.7 300 100.1 0.7 2.0 64.9 76.3 0.1 99.0 4.1 7.5 114.6 88.2 1 105.5 5.9 5.8 85.8 104.1 30 104.4 3.4 E 5.5 69.9 92.2 _________________________________ 12

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