血液中溴敌隆等 13 种抗凝血类杀鼠药的液相色谱-串联质谱检验方法.pdf 
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司 法 鉴 定 技 术 规 范 SF/Z JD0107018——2018 血液中溴敌隆等 13 种抗凝血类杀鼠药的 液相色谱-串联质谱检验方法 Determination of 13 anticoagulant rodenticides including bromadiolone in blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2018-11-08 发布 中华人民共和国司法部公共法律服务管理局 2019-01-01 实施 发 布 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 原理 .............................................................................. 1 5 试剂、仪器和材料 .................................................................. 1 6 操作方法 .......................................................................... 2 7 分析结果评价 ...................................................................... 7 附录 A（资料性附录） 血液中 13 种抗凝血类杀鼠药的多反应监测(MRM)色谱图 ................ 8 附录 B（资料性附录） 方法学有效性验证数据 ........................................... 10 表 1 流动相梯度洗脱程序 .............................................................. 3 表 2 13 种抗凝血类杀鼠药和内标的定性离子对、定量离子对和保留时间 ..................... 3 表 3 相对离子对丰度比的最大允许相对误差 .............................................. 4 SF/Z JD0107018——2018 前 言 本技术规范按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本技术规范由司法鉴定科学研究院提出。 本技术规范由司法部公共法律服务管理局归口。 本技术规范起草单位：司法鉴定科学研究院。 本技术规范主要起草人：严慧、卓先义、刘伟、向平、沈保华、乔正、沈敏、吴何坚。 本技术规范的附录 A、B 为资料性附录。 本技术规范为首次发布。 II SF/Z JD0107018——2018 血液中溴敌隆等 13 种抗凝血类杀鼠药的液相色谱-串联质谱检验方 法 1 范围 本技术规范规定了血液中溴敌隆、溴鼠灵、克灭鼠、异杀鼠酮、杀鼠酮、华法林、杀鼠醚、氯杀鼠 灵、敌鼠、敌害鼠、氯鼠酮、鼠得克和氟鼠灵等 13 种抗凝血类杀鼠药的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS) 检验方法。 本技术规范适用于血液中溴敌隆、溴鼠灵、克灭鼠、异杀鼠酮、杀鼠酮、华法林、杀鼠醚、氯杀鼠 灵、敌鼠、敌害鼠、氯鼠酮、鼠得克和氟鼠灵等13种抗凝血类杀鼠药的定性及定量分析，其它生物检材 和非生物检材中13种抗凝血类杀鼠药的定性及定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GA/T 122 毒物分析名词术语 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 GA/T 122 中界定的术语和定义适用于本技术规范。 4 原理 血液经液液提取后用液相色谱-串联质谱法进行检测。经与平行操作的空白样品和添加样品对照， 以保留时间、质谱特征碎片离子峰和离子对相对丰度比进行定性分析；以峰面积为依据，采用内标法或 外标法进行定量分析。 5 试剂、仪器和材料 5.1 试剂 本技术规范所用试剂除另有说明外均为分析纯，试验用水为一级水（见GB/T 6682规定），所用试 剂： a) 甲醇：HPLC 级； b) 乙酸铵：HPLC 级； c) 乙酸乙酯； 1 SF/Z JD0107018——2018 d) 溴敌隆、溴鼠灵、克灭鼠、异杀鼠酮、杀鼠酮、华法林、杀鼠醚、氯杀鼠灵、敌鼠、敌害鼠、 氯鼠酮、鼠得克和氟鼠灵标准物质； e) 内标为华法林-d5 或其它合适内标物； f) 标准物质溶液： 1) 1.0mg/mL 对照品标准储备溶液：分别取溴敌隆、溴鼠灵、克灭鼠、异杀鼠酮、杀鼠酮、 华法林、杀鼠醚、氯杀鼠灵、敌鼠、敌害鼠、氯鼠酮、鼠得克和氟鼠灵标准物质适量，精 密称定，用甲醇或丙酮配成 1.0mg/mL 的标准储备溶液，置于冰箱中冷冻保存，保存时间 12 个月。 2) 标准工作溶液：试验中所用其他浓度的标准溶液均从上述储备溶液用甲醇稀释而得。密封， 置于冰箱中冷藏保存，保存时间 3 个月； g) 内标华法林-d5 标准溶液: 1) 100µg/mL 内标物华法林-d5 对照品标准溶液： 市售华法林-d5 的甲醇溶液浓度为 100µg/mL， 置于冰箱冷冻保存。 2) 100ng/mL 内标物华法林-d5 对照品工作溶液：将华法林-d5 储备液用甲醇稀释 1000 倍，得 100ng/mL 的华法林-d5 标准工作液。密封，置于冰箱中冷藏保存，保存时间 3 个月。 5.2 仪器和材料 仪器和材料包括： a) 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI-)； b) 电子分析天平：感量 0.1mg； c) 旋涡混合器； d) 离心机； e) 恒温水浴锅； f) 移液器。 6 操作方法 6.1 定性分析 6.1.1 样品前处理 6.1.1.1 案件样品 取血液1mL，加入乙酸乙酯3mL，涡旋混合，以2500r/min离心3min，将上清液转移至另一离心管中， 再加入3mL乙酸乙酯，重复提取一次，合并有机相，于60℃水浴空气流下吹干，残留物用100L甲醇复 溶，供仪器分析。 6.1.1.2 控制样品 取空白血液1mL两份，一份作为空白样品，一份添加溴敌隆或其它可疑鼠药标准工作溶液作为 2ng/mL添加样品，余下同6.1.1.1，与案件样品平行操作。 6.1.2 仪器检测 6.1.2.1 仪器条件 6.1.2.1.1 液相色谱条件 2 SF/Z JD0107018——2018 以下为参考条件，可根据不同仪器实际情况进行调整： a) 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 柱（或其它等效柱），100mm×2.1 mm, 3.5µm； 注：Agilent Eclipse Plus C18柱为Agilent公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本技术规范的使用者，并不 是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相：A 为 10mmol/L 乙酸铵溶液（含 5%甲醇）、B 为甲醇，流动相梯度洗脱程序见表 1； 表1 流动相梯度洗脱程序 时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%) 0 80 20 1.5 80 20 3 40 60 5 40 60 5.5 15 85 7.5 15 85 10 80 20 c) 流速：200µL/min； d) 柱温：室温； e) 进样量：5µL。 6.1.2.1.2 质谱条件 以下为参考条件，可根据不同仪器实际情况进行调整： a) 离子源：电喷雾电离-负离子模式(ESI-)； b) 检测方式：多反应监测(MRM)； c) 离子喷雾电压(IS)：-4500V； d) 碰撞气(CAD)、气帘气(CUR)、雾化气(GS1)、辅助气(GS2)均为高纯氮气，使用前调节各气流 流量以使质谱灵敏度达到检测要求； e) 去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)应优化至最佳灵敏度。 在以上色谱、质谱条件下，13种抗凝血类杀鼠药和内标的定性离子对、定量离子对和保留时间见表 2，MRM色谱图参见附录A。 表2 13 种抗凝血类杀鼠药和内标的定性离子对、定量离子对和保留时间 名称 定性离子对/ 定量离子对/ (m/z) (m/z) 保留时间/ (min) 297.1/161.1 克灭鼠 297.1/161.1 4.83 229.0/144.7 5.28 229.1/116.0 5.30 297.1/210.7 229.0/144.7 异杀鼠酮 229.0/116.0 杀鼠酮 229.1/116.0 3 SF/Z JD0107018——2018 229.1/172.0 312.2/161.0 华法林-d5 312.2/161.0 5.39 307.2/160.8 5.44 291.1/140.9 5.66 341.0/161.0 6.24 339.1/167.1 6.74 335.1/160.8 6.83 373.0/200.9 7.39 525.1/250.1 7.83 443.3/135.0 7.96 541.3/382.3 8.19 521.1/134.9 8.67 312.2/255.0 307.2/160.8 华法林 307.2/250.0 291.1/140.9 杀鼠醚 291.1/247.0 341.0/161.0 氯杀鼠灵 341.0/283.8 339.1/167.1 敌鼠 339.1/145.2 敌害鼠 335.1/160.8 373.0/200.9 氯鼠酮 373.0/145.2 525.1/250.1 溴敌隆 525.1/272.9 443.3/135.0 鼠得克 443.3/293.2 541.3/382.3 氟鼠灵 541.3/161.1 521.1/134.9 溴鼠灵 521.1/187.0 6.1.2.2 进样 分别吸取案件样品、空白样品和添加样品提取液，按6.1.2.1条件进样分析。 6.1.2.3 记录 记录各样品中可疑色谱峰的保留时间和离子对丰度比。 6.1.2.4 定性判断依据 以保留时间、质谱特征碎片离子峰和离子对相对丰度比作为定性判断依据。 如果案件样品中出现13种抗凝血类杀鼠药定性离子对的特征色谱峰，保留时间与添加样品中相应标 准物质的色谱峰保留时间比较，相对误差在±2.5%以内，且定性离子对丰度比与浓度相近添加样品的离 子对丰度比之相对误差不超过表3规定的范围，则可判断案件样品中存在该种目标物。 4 SF/Z JD0107018——2018 表3 相对离子对丰度比的最大允许相对误差(%) 相对离子对丰度比 >50 >2050 >1020 10 允许的相对误差 20 25 30 50 6.2 定量分析 本技术规范采用内标法或外标法定量测定。 6.2.1 样品前处理 取案件样品血液1mL两份，加入内标100ng/mL华法林-d5标准工作溶液10µL（外标法可不用加）， 余下同6.1.1.1。 取空白血液样品若干份，添加相应目标物适量，制得系列浓度或单点浓度的添加样品。与案件样品 平行操作。方法有效性验证数据参见附录B。 案件样品中目标物的浓度应在工作曲线的线性范围内。制备单点浓度的添加样品时，案件样品中目 标物浓度需在该添加样品对照品浓度的±50%内。 6.2.2 仪器检测 6.2.2.1 仪器参考条件 同6.1.2.1。 6.2.2.2 进样 分别将案件样品、系列浓度的添加样品或单点浓度添加样品，按6.1.2.1条件进样分析。 6.2.3 记录与计算 记录案件样品、系列浓度的添加样品或单点浓度添加样品中目标物及内标物华法林-d5 的定量离子 对的峰面积值，然后计算案件样品中目标物含量。 6.2.3.1 外标法 6.2.3.1.1 外标-工作曲线法 在系列浓度的添加样品中，以目标物定量离子对的峰面积值（Y）为纵坐标、目标物质量浓度（C） 为横坐标进行线性回归，得线性方程。 根据案件样品中目标物的峰面积值，按公式(1)计算出案件样品中目标物的质量浓度。 C= Y −a b ................................................................................. (1) 式中： C——案件样品中目标物的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； Y——案件样品中目标物的峰面积值； a ——线性方程的截距； b ——线性方程的斜率。 6.2.3.1.2 外标-单点校正法 根据案件样品和添加样品中目标物的峰面积值，按公式（2）计算出案件样品中目标物的含量。 5 SF/Z JD0107018——2018 C= A c ............................................................................（2） A 式中： C⎯⎯案件样品中目标物的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； A⎯⎯案件样品中目标物的峰面积值； A′⎯⎯添加样品中目标物的峰面积值； c⎯⎯添加样品中目标物的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）。 6.2.3.2 内标法 6.2.3.2.1 内标-工作曲线法 在系列浓度的添加样品中，以目标物与内标物华法林-d5定量离子对的峰面积比（Y）为纵坐标、目 标物质量浓度（C）为横坐标进行线性回归，得线性方程。 根据案件样品中目标物及内标物华法林-d5定量离子对的峰面积值，按公式(3)计算含量。 C= Y −a ................................................................................. (3) b 式中： C——案件样品中目标物的质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)； Y——案件样品中目标物与内标物华法林-d5定量离子对的峰面积比； a——线性方程的截距； b——线性方程的斜率。 6.2.3.2.2 内标-单点校正法 根据案件样品和添加样品中目标物与内标物华法林-d5 定量离子对的峰面积比值，按公式（4）计算 含量： C= A c .................................................................................. (4) A 式中： C——案件样品中目标物的质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)； A——案件样品中目标物与内标物华法林-d5的峰面积比值； A′——添加样品中目标物与内标物华法林-d5的峰面积比值； c ——添加样品中目标物的质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)。 6.2.4 计算相对相差 案件样品按以上步骤平行测定两份，双样相对相差按公式(5)计算： RD= C1 − C2 C 100 %……………...…………..………..………(5) 式中： 6 SF/Z JD0107018——2018 RD——相对相差； C1、C2——两份案件样品平行定量测定的结果，单位为纳克每毫升(ng/mL)； C ——两份案件样品平行定量测定结果的平均值(C1+ C2)/ 2，单位为纳克每毫升(ng/mL)。 7 分析结果评价 7.1 定性分析结果评价 7.1.1 阴性结果评价 如果案件样品中未检出抗凝血类杀鼠药，添加样品中检出抗凝血类杀鼠药，则阴性结果可靠；如果 添加样品中未检出抗凝血类杀鼠药，则阴性结果不可靠，应按6.1重新提取检验。 7.1.2 阳性结果评价 如果案件样品中检出抗凝血类杀鼠药且空白样品无干扰，则阳性结果可靠；如果空白样品亦呈阳性， 则阳性结果不可靠，应按6.1重新提取检验。 7.2 定量分析结果评价 两份案件样品的相对相差在20%以内（腐败检材在±30%以内）时，结果按两份案件样品含量的平均 值计算，否则需要重新测定。 7 SF/Z JD0107018——2018 AA 附 录 A （资料性附录） 血液中 13 种抗凝血类杀鼠药的多反应监测(MRM)色谱图 血液中13种抗凝血类杀鼠药的 MRM色谱图,见图A.1。 8 SF/Z JD0107018——2018 图A.1 空白血液中添加 13 种抗凝血类杀鼠药（10ng/mL)和内标(1ng/mL)的 MRM 色谱图 9 SF/Z JD0107018——2018 BB 附 录 B （资料性附录） 方法学有效性验证数据 B.1 工作曲线 本技术规范血液中13种抗凝血类杀鼠药的检出限和定量下限分别为0.2ng/mL和0.5ng/mL。 表B.1 线性方程和线性范围 目标物 线性范围 (ng/mL) 线性方程 相关系数 r 克灭鼠 0.5-50 y = 0.197x - 0.039 0.9988 异杀鼠酮 0.5-50 y = 0.575x - 0.132 0.9994 杀鼠酮 0.5-50 y = 0.535x - 0.158 0.9985 华法林 0.5-50 y = 1.160x + 0.038 0.9993 杀鼠醚 0.5-50 y = 0.815x - 0.194 0.9993 氯杀鼠灵 0.5-50 y = 0.232x + 0.017 0.9998 敌鼠 0.5-50 y = 0.092x - 0.008 0.9995 敌害鼠 0.5-50 y = 1.780x - 0.031 0.9997 氯鼠酮 0.5-50 y = 0.126x - 0.013 0.9992 溴敌隆 0.5-50 y = 0.099x - 0.032 0.9989 鼠得克 0.5-50 y = 0.073x - 0.022 0.9976 氟鼠灵 0.5-50 y = 0.247x - 0.104 0.9952 溴鼠灵 0.5-50 y = 0.059x - 0.013 0.9966 B.2 方法准确度、精密度和回收率 表B.2 方法准确度、精密度和回收率 目标物 添加浓度 准确度/% 精密度/% 回收率/% (ng/mL) (n=24) 日内 RSD(n=6) 日间 RSD(n=64d) (n=6) 0.5 105.73 2.47 7.17 63.37 5 89.46 0.20 4.21 54.27 克灭鼠 10 SF/Z JD0107018——2018 异杀鼠酮 杀鼠酮 华法林 杀鼠醚 氯杀鼠灵 敌鼠 敌害鼠 氯鼠酮 溴敌隆 鼠得克 氟鼠灵 40 103.33 8.66 5.79 66.62 0.5 108.53 4.36 8.70 57.10 5 91.97 1.59 7.15 52.43 40 103.54 3.18 7.44 53.17 0.5 99.03 3.97 6.80 56.12 5 86.00 3.16 5.26 52.57 40 101.16 2.37 8.59 52.40 0.5 106.35 2.18 9.74 89.11 5 98.87 3.46 4.20 58.70 40 101.86 1.80 6.43 84.40 0.5 108.37 1.67 4.31 68.02 5 95.85 1.93 4.35 79.10 40 99.32 7.18 5.46 80.09 0.5 106.40 1.28 8.89 73.15 5 97.41 1.81 12.61 61.07 40 107.17 7.06 10.42 77.98 0.5 107.49 1.95 7.48 65.45 5 93.77 3.31 12.38 65.49 40 100.92 3.51 9.90 83.96 0.5 107.27 5.27 10.33 54.72 5 90.71 3.74 8.02 58.83 40 95.38 5.73 9.54 69.44 0.5 93.96 3.93 8.23 59.15 5 95.51 4.58 10.85 73.04 40 108.51 8.10 9.59 80.19 0.5 99.96 4.73 12.51 62.67 5 85.65 5.34 6.03 51.43 40 101.99 8.22 12.84 58.33 0.5 100.78 4.94 7.34 56.08 5 88.36 8.79 7.95 50.91 40 97.94 4.13 12.54 58.21 0.5 89.12 1.62 7.77 51.29 11 SF/Z JD0107018——2018 溴鼠灵 5 93.48 2.76 3.98 55.34 40 100.73 5.46 5.67 54.52 0.5 96.38 6.18 10.67 50.05 5 83.78 8.95 11.13 50.18 40 96.88 4.55 8.78 58.53 _________________________________ 12